FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)是目前功能強大全面的植物顯微熒光研究儀器，是基于FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)的顯微成像定制系統(tǒng)。它由包含可擴展部件的增強顯微鏡、高分辨率CCD相機、激發(fā)光源組、光譜儀、控溫模塊以及相應(yīng)的控制單元和的工作站與分析軟件組成。它不僅可以進行微藻、單個細胞、單個葉綠體乃至基粒-基質(zhì)類囊體片段進行Fv/Fm、Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng)、熒光淬滅、OJIP快速熒光響應(yīng)曲線、QA再氧化等各種葉綠素熒光及MCF多光譜熒光（multicolor fluorescence）成像分析；還能通過激發(fā)光源組進行進行任意熒光激發(fā)和熒光釋放波段的測量，從而進行GFP、DAPI、DiBAC4、SYTOX、CTC等熒光蛋白、熒光染料以及藻青蛋白、藻紅蛋白、藻膽素等藻類熒光色素的成像分析；更可以利用光譜儀對各種熒光進行光譜分析，區(qū)分各發(fā)色團（例如PSI和PSII及各種捕光色素復(fù)合體等）并進行深入分析。

  FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)使熒光成像技術(shù)真正成為光合作用機理研究的探針，使科研工作者在藻類和高等植物細胞與亞細胞層次深入理解光合作用過程及該過程中發(fā)生的各種變化，為直接研究葉綠體中光合系統(tǒng)的工作機理提供了為有力的工具。FKM作為藻類/植物表型和基因型顯微研究的雙重利器，得到了學界的廣泛認可并取得了大量的科研成果。

功能特點

•內(nèi)置現(xiàn)今葉綠素熒光研究的全部程序，如Fv/Fm、Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng)、熒光淬滅、OJIP快速熒光響應(yīng)曲線、QA再氧化等，可獲得70余項參數(shù)。

•配備10倍、20倍、40倍、63倍和100倍生物熒光物鏡，可以清晰觀測到葉綠體及其發(fā)出的熒光。

•激發(fā)光源組中包括紅外光、紅光、藍光、綠光、白光、紫外光和遠紅光等，通過紅藍綠三色光還可以調(diào)出可見光譜中的任何一種色光，能夠研究植物/藻類中任何一種色素分子或發(fā)色團。

•可進行GFP、DAPI、DiBAC4、SYTOX、CTC等熒光蛋白、熒光染料的成像分析

•高分辨率光譜儀能夠深入解析各種熒光的光譜圖。

•控溫系統(tǒng)可以保證實驗樣品在同等溫度條件下進行測量，提高實驗精度，也可以進行高溫/低溫脅迫研究。

應(yīng)用領(lǐng)域

• 微藻、大型藻類/高等植物的單個細胞、單個葉綠體、基粒-基質(zhì)類囊體片段等的顯微結(jié)構(gòu)植物光合生理研究

• 藻類/植物逆境研究

• 生物和非生物脅迫的研究

• 藻類/植物抗脅迫能力及易感性研究

• 突變體篩選及光合機理研究

• 藻類長勢與產(chǎn)量評估

• 藻類色素與光合作用關(guān)系

• 藻類/植物——微生物交互作用研究

• 藻類/植物——原生動物交互作用研究

• 基因工程與分子生物學研究

測量樣品

• 植物活體切片

• 植物表皮

• 植物細胞

• 綠藻、藍藻等各種單細胞和多細胞微藻

• 葉綠體提取液

• 類囊體提取液

• 含有葉綠體的原生動物

工作原理

  FKM分析過程中，通過連接在顯微鏡上的激發(fā)光源組和內(nèi)置在6位濾波輪中的一系列濾波器、分光鏡激發(fā)植物樣品中各種發(fā)色團的動態(tài)熒光。樣品激發(fā)出的熒光經(jīng)顯微鏡放大后進行熒光光譜分析和熒光動力學成像分析。SM 9000光譜儀通過光纖與顯微鏡連接，以進行激發(fā)熒光光譜分析。安裝在顯微鏡頂部的高分辨率CCD相機則用于熒光動力學成像分析。全部工作過程通過工作站和控制單元按照預(yù)先設(shè)定好的程序自動進行。測量過程中，可通過溫控模塊調(diào)控藻類、植物細胞等實驗樣品的溫度。蠕動泵可以實現(xiàn)培養(yǎng)藻類的連續(xù)測量。

儀器組成

1. 增強顯微鏡 

2. 高分辨率CCD相機 

3. 激發(fā)光源組 

4. SM 9000光譜儀 

5. 主控制單元 

6. 工作站及軟件 

7. 控溫模塊的控制單元

8. 6位濾波輪

技術(shù)參數(shù)

• 測量參數(shù)

?Fo, Fo’, Fs, Fm, Fm’, Fp, FtDn, FtLn, Fv, Fv'/ Fm', Fv/ Fm ,Fv',Ft,ΦPSII, NPQ_Dn, NPQ_Ln, Qp_Dn, Qp_Ln, qN, qP，QY, QY_Ln, Rfd, ETR等50多個葉綠素熒光參數(shù)，每個參數(shù)均可顯示2維熒光彩色圖像

?OJIP快速熒光曲線：測定分析OJIP曲線與二十幾項相關(guān)參數(shù)包括：Fo、Fj、Fi、P或Fm、Vj、Vi、Mo、Area 、Fix Area、Sm 、Ss 、N（QA還原周轉(zhuǎn)數(shù)量）、Phi¬¬¬_Po 、Psi_o 、Phi_Eo、Phi_Do、Phi_pav、ABS/RC（單位反應(yīng)中心的吸收光量子通量）、TRo/RC（單位反應(yīng)中心初始捕獲光量子通量）、ETo/RC（單位反應(yīng)中心初始電子傳遞光量子通量）、DIo/RC（單位反應(yīng)中心能量散失）、ABS/CS（單位樣品截面的吸收光量子通量）、TRo/CSo、RC/CSx（反應(yīng)中心密度）、PIABS（基于吸收光量子通量的“性能”指數(shù)或稱生存指數(shù)）、PIcs（基于截面的“性能”指數(shù)或稱生存指數(shù)）等（選配）

?GFP、DAPI、DiBAC4、SYTOX、CTC等熒光蛋白和熒光染料的成像分析（選配）

?QA再氧化動力學曲線（選配）

?Spectrum熒光光譜圖（選配）

•具備完備的自動測量程序（protocol），可自由對自動測量程序進行編輯

?Fv/Fm：測量參數(shù)包括Fo，F(xiàn)m，F(xiàn)v，QY等

?Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng)：Fo，F(xiàn)p，F(xiàn)v，F(xiàn)t_Lss，QY，Rfd等熒光參數(shù)

?熒光淬滅分析：Fo，F(xiàn)m，F(xiàn)p，F(xiàn)s，F(xiàn)v，QY，ΦII，NPQ，Qp，Rfd，qL等50多個參數(shù)，2套制式程序

?光響應(yīng)曲線LC：Fo，F(xiàn)m，QY，QY_Ln，ETR等熒光參數(shù)

?Dyes & FPs穩(wěn)態(tài)熒光成像測量

?OJIP快速熒光動力學分析：Mo（OJIP曲線初始斜率）、OJIP固定面積、Sm（對關(guān)閉所有光反應(yīng)中心所需能量的量度）、QY、PI等26個參數(shù)（選配）

?QA再氧化動力學（選配）

?Spectrum熒光光譜分析（選配）

•熒光激發(fā)光源：紅外光、紅光、橙光、藍光、綠光、白光、紫外光等可選，根據(jù)客戶要求定制光源組

•透射光源（選配）：白光、遠紅光

?高分辨率TOMI-2 CCD傳感器：

?逐行掃描CCD

?高圖像分辨率：1360×1024像素

?時間分辨率：在高圖像分辨率下可達每秒20幀

?A/D 轉(zhuǎn)換分辨率：16位（65536灰度色階）

?像元尺寸：6.45µm×6.45µm

?運行模式：1）動態(tài)視頻模式，用于葉綠素熒光參數(shù)測量；2）快照模式，用于GFP等熒光蛋白和熒光染料測量

?通訊模式：千兆以太網(wǎng)

•顯微鏡：Axio Imager M2，可選配Axio Scope A1簡潔版或Axio Imager Z2高級版

?物鏡轉(zhuǎn)盤：研究級7孔自動物鏡轉(zhuǎn)盤

?透射光快門

?聚光器 Achr Apl 0.9 H

?6位反光鏡轉(zhuǎn)盤

?雙目鏡筒(100:0/30:70/0:100)

?機械載物臺：75×50mm，硬膜陽極氧化表面

?樣品架：76×26mm

•物鏡：10倍、20倍、40倍、63倍和100倍生物熒光物鏡（可選）

•6位濾波輪：葉綠素熒光、GFP/SYTOX、DAPI/CTC等

•SM9000光譜儀

?入射狹縫：70µm×1400µm 

?光柵：平場型校正

?光譜范圍：200-980nm

?波長精確度：<0.5nm

?再現(xiàn)性：<0.1nm

?溫度漂移：<0.01nm/K

•溫度調(diào)控模塊：溫度調(diào)節(jié)范圍 5℃-70℃，精確度0.1℃

•蠕動泵（選配）：流速10-5600µl/min，用于藻類連續(xù)培養(yǎng)測量

•FluorCam葉綠素熒光成像分析軟件功能：具Live（實況測試）、Protocols（實驗程序選擇定制）、Pre–processing（成像預(yù)處理）、Result（成像分析結(jié)果）等功能菜單

•客戶定制實驗程序協(xié)議（protocols）：可設(shè)定時間（如測量光持續(xù)時間、光化學光持續(xù)時間、測量時間等）、光強（如不同光質(zhì)光化學光強度、飽和光閃強度、調(diào)制測量光等），具備實驗程序語言和腳本，用戶也可利用Protocol菜單中的向?qū)С绦蚰０孀杂蓜?chuàng)建新的實驗程序

•自動測量分析功能：可設(shè)置一個實驗程序（Protocol）自動無人值守循環(huán)成像測量，重復(fù)次數(shù)及間隔時間客戶自定義，成像測量數(shù)據(jù)自動按時間日期存入計算機（帶時間戳）

•快照（snapshot）模式：通過快照成像模式，可以自由調(diào)節(jié)光強、快門時間及靈敏度得到清晰突出的植物樣本穩(wěn)態(tài)熒光和瞬時熒光圖片

•成像預(yù)處理：程序軟件可自動識別多個植物樣品或多個區(qū)域，也可手動選擇區(qū)域（Region of interest，ROI）。手動選區(qū)的形狀可以是方形、圓形、任意多邊形或扇形。軟件可自動測量分析每個樣品和選定區(qū)域的熒光動力學曲線及相應(yīng)參數(shù)，樣品或區(qū)域數(shù)量不受限制（>1000）

•數(shù)據(jù)分析模式：具備“信號計算再平均”模式（算數(shù)平均值）和“信號平均再計算”模式，在高信噪比的情況下選用“信號計算再平均”模式，在低信噪比的情況下選擇“信號平均再計算”模式以過濾掉噪音帶來的誤差

•輸出結(jié)果：高時間解析度熒光動態(tài)圖、熒光動態(tài)變化視頻、熒光參數(shù)Excel文件、直方圖、不同參數(shù)成像圖、不同ROI的熒光參數(shù)列表等

葉綠素熒光與光譜分析結(jié)果

典型應(yīng)用：

產(chǎn)地：捷克

參考文獻：

1.Küpper H, et al. 2019. Analysis of OJIP Chlorophyll Fluorescence Kinetics and QA Reoxidation Kinetics by Direct Fast Imaging. Plant Physiology 179: 369-381

2.Konert G, et al. 2019. Protein arrangement factor: a new photosynthetic parameter characterizing the organization of thylakoid membrane proteins. Physiologia Plantarum 166: 264-277.

3.Exposito-Rodriguez M, et al. 2017. Photosynthesis-dependent H2O2 transfer from chloroplasts to nuclei provides a high-light signalling mechanism. Nature Communications, 8: 49

4.Higo S, et al. 2017. Application of a pulse-amplitude-modulation (PAM) fluorometer reveals its usefulness and robustness in the prediction of Karenia mikimotoi blooms: A case study in Sasebo Bay, Nagasaki, Japan. Harmful Algae, 61:63-70

5.Jacobs M, et al. 2016. Photonic multilayer structure of Begonia chloroplasts enhances photosynthetic efficiency. Nature Plants, doi:10.1038/nplants.2016.162

6.Andresen E, et al. 2016. Cadmium toxicity investigated at the physiological and biophysical levels under environmentally relevant conditions using the aquatic model plant Ceratophyllum demersum. New Phytol., 210(4):1244-1258

7.Thomas G, et al. 2016. Deficiency and toxicity of nanomolar copper in low irradiance—A physiological and metalloproteomic study in the aquatic plant Ceratophyllum demersum. Aquatic Toxicology, 177:226-236

8.Fujise L, et al. 2014. Moderate Thermal Stress Causes Active and Immediate Expulsion of Photosynthetically Damaged Zooxanthellae (Symbiodinium) from Corals. PLOS ONE,  DOI:10.1371/journal.pone.0114321

9.Gorecka M, et al. 2014. Abscisic acid signalling determines susceptibility of bundle sheath cells to photoinhibition in high light-exposed Arabidopsis leaves. Philosophical Transactions of the Royal Society B, 369(1640), DOI: 10.1098/rstb.2013.0234

10.Mishra S, et al. 2014. A different sequence of events than previously reported leads to arsenic-induced damage in Ceratophyllum demersum L. Metallomics, 6: 444-454

11.Ferimazova N, et al. 2013. Regulation of photosynthesis during heterocyst differentiation in Anabaena sp. strain PCC 7120 investigated in vivo at single-cell level by chlorophyll fluorescence kinetic microscopy. Photosynthesis Research, 116(1): 79-91

12.Andresen E, et al. 2013. Effects of Cd & Ni toxicity to Ceratophyllum demersum under environmentally relevant conditions in soft & hard water including a German lake. Aquatic Toxicology. 142–143, 15: 387–402