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本文介紹幾種常見(jiàn)的微生物基礎(chǔ)試驗(yàn)的目的、原理、內(nèi)容等,以便剛剛接觸微生物的同-志們對(duì)試驗(yàn)有個(gè)基本的認(rèn)識(shí).

實(shí)驗(yàn)一 常用培養(yǎng)基的制備、滅菌與消毒
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />1、掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟;掌握干熱天菌、高壓蒸汽滅菌及過(guò)濾除菌的操作方法;
2、了解培養(yǎng)基的配制原理;了解常見(jiàn)滅菌、清毒基本原理及方法.

二、實(shí)驗(yàn)原理
培養(yǎng)基是人工按一定比例配制的供微生物生長(zhǎng)繁殖和合成代謝產(chǎn)物所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物.培養(yǎng)基的原材料可分為碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因素和水.根據(jù)微生物的種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?培養(yǎng)基也有不同的種類和配制方法.
牛-肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用-廣泛和普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基,有時(shí)又稱為普通培養(yǎng)基.由于這種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需要的基本的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),所以可供微生物生長(zhǎng)繁殖之用.
干熱天菌、高壓蒸汽滅菌方法主要是通過(guò)升溫使蛋白質(zhì)變性從而達(dá)到殺死微生物的效果.

三、試劑與器材
1、器材 試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養(yǎng)基、分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH度紙、棉花、牛皮紙、記號(hào)筆、麻繩、紗布、吸管、培養(yǎng)皿、電烘箱、注射器、微孔濾膜過(guò)濾器、鑷子等.
2、試劑 牛-肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
1、稱量→溶化→調(diào)pH→過(guò)濾→分裝→加塞→包扎→滅菌→無(wú)菌檢查
2、干熱滅菌:裝入待滅菌物品→升溫→恒溫?fù)u床→降溫→開(kāi)箱取物
3、高壓蒸汽滅菌:加水→裝物品→加蓋→加熱→排冷空氣→加壓→恒壓→降壓回零→排汽→取物→無(wú)菌檢查
4、過(guò)濾除菌:組裝滅菌→連接→壓濾→無(wú)菌檢查→清洗滅菌

五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)
1、要嚴(yán)格按配方配制.
2、調(diào)pH不要過(guò)頭.
3、干熱滅菌要注意物品不要堆放過(guò)緊,注意溫度的時(shí)間控制,70oC以下放物、取物.
4、高壓滅菌要注意物品不要過(guò)多,加熱后排除冷空氣,到時(shí)降壓回零取物.
5、過(guò)濾除菌要注意各部件滅菌,壓濾時(shí),壓力要適當(dāng),不可太猛太快,濾膜要注意清洗保存.

實(shí)驗(yàn)二 土壤中微生物分離純化培養(yǎng)
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />1、掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術(shù);掌握微生物培養(yǎng)方法;
2、了解不同的微生物菌落在斜面上、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特征;進(jìn)一步熟練和掌握微生物無(wú)菌操作技術(shù).

二、實(shí)驗(yàn)原理
從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱為微生物的分離與純化.
常用的分離、純化方法:單細(xì)胞挑取法,稀釋涂布平板法,稀釋混合平板法,平板劃線法.
稀釋涂布平板法步驟:倒平板－制備土壤污水稀釋液－涂布－培養(yǎng)－挑菌落.
平板劃線法步驟:倒平板－標(biāo)記培養(yǎng)基名稱－劃線.

三、試劑與器材
1、器材 盛9ml無(wú)菌水的試管、盛90ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶、無(wú)菌玻璃涂棒、無(wú)菌吸管、接種環(huán)、酒精燈、無(wú)菌培養(yǎng)皿、顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板等.
2、試劑 牛-肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,高氏1號(hào)培養(yǎng)基,查氏培養(yǎng)基

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
1、土壤稀釋液的制備
2、微生物分離純化:稀釋涂平板法,平皿劃線分離法,微生物培養(yǎng)技術(shù)

五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)
1、掌握含菌培養(yǎng)基的配制,嚴(yán)格控制溫度.
2、平板劃線應(yīng)防止染菌,同時(shí)應(yīng)注意劃線深度及密度.

實(shí)驗(yàn)三 菌種保藏
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />1、學(xué)習(xí)并掌握菌種保藏的基本原理.
2、掌握常用的幾種不同的菌種保藏方法.

二、實(shí)驗(yàn)原理
微生物個(gè)體微小、代謝旺盛、生長(zhǎng)繁殖快,如果保存不妥容易發(fā)生變異和雜菌污染,甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡等現(xiàn)象.因此,保存好菌種是非常必要和重要的.常用的菌種保藏方法包括傳代培養(yǎng)法、載體法、懸液法、冷凍法和真空干燥法

三、試劑與器材
1、材料 大腸桿菌、青霉菌、放線菌
2、試劑 液體石蠟、甘油、五氧化二磷、95％乙醇、10％鹽酸、無(wú)水氯化鈣、食鹽、干冰
3、器材 無(wú)菌吸管、無(wú)菌滴管、無(wú)菌培養(yǎng)皿;安額管、凍干管、40目與100目篩子、油紙、濾紙條(0.5X1、2cm)、干燥器、真泵器、真空泵、真空壓力表、噴燈、L形五通管、冰箱、低溫冰箱(—30℃)、超低溫冰箱和液氮罐等.

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
1、斜面保藏法
2、液體石蠟法
3、穿刺保藏法
4、砂土管保藏法
5、冷凍真空干燥保存法

五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)
1、清楚各種保藏方法的優(yōu)缺點(diǎn),針對(duì)不同要求選擇適宜的保藏方法.
2、熔封安瓶時(shí)防止封閉不嚴(yán).
3、液氮凍存操作應(yīng)防止凍傷.

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />1、了解簡(jiǎn)單染色法的原理,并掌握其操作方法.
2、學(xué)習(xí)并掌握微生物涂片、染色的基本技術(shù)和無(wú)菌操作技術(shù).
3、鞏固顯微鏡(油鏡)的使用方法.
4、初步認(rèn)識(shí)細(xì)菌的形態(tài)特征.

二、實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)菌個(gè)體微小,且較透明,必須借助染色法使菌體著色,與背景形成鮮明的對(duì)比,以便在顯微鏡下進(jìn)行觀察.根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?可分為簡(jiǎn)單染色法、鑒別染色法和特殊染色法等.簡(jiǎn)單染色法是基本的染色方法,是利用單一染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色.此法操作簡(jiǎn)便,適用于菌體一般形狀和細(xì)菌排列的觀察.常用堿性染料進(jìn)行簡(jiǎn)單染色.

三、試劑與器材
1、材料 大腸桿菌,枯草芽孢桿菌
2、試劑 呂氏堿性美藍(lán)染液(或草酸銨結(jié)晶紫染液)、齊氏石炭酸復(fù)紅染液.
3、器材 顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環(huán)、雙層瓶(內(nèi)裝香柏油和二甲苯)等.

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
簡(jiǎn)單染色法:涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢

五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)
1、涂片時(shí),生-理鹽水及取菌不宜過(guò)多,涂片應(yīng)盡可能均勻,
2、水洗步驟水流不宜過(guò)大,過(guò)急,以免涂片薄膜脫落.

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />1、了解放線菌、霉菌形態(tài)觀察的原理;
2、學(xué)習(xí)并掌握觀察放線菌、霉菌形態(tài)的操作方法;
3、初步了解放線菌、霉菌的形態(tài)特征.

二、實(shí)驗(yàn)原理
放線菌是指能形成分枝絲狀體或菌絲體的一類革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌.常見(jiàn)放線菌大多能形成菌絲體,緊貼培養(yǎng)基表面或深入培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)的叫基內(nèi)菌絲(簡(jiǎn)稱“基絲”),基絲生長(zhǎng)到一定階段還能向空氣中生長(zhǎng)出氣生菌絲(簡(jiǎn)稱“氣絲”),并進(jìn)一步分化產(chǎn)生孢子絲及孢子.有的放線菌只產(chǎn)生基絲而無(wú)氣絲.在顯微鏡下直接觀察時(shí),氣絲在上層、基絲在下層,氣絲色暗,基絲較透明.孢子絲依種類的不同,有直、波曲、各種螺旋形或輪生.
霉菌可產(chǎn)生復(fù)合分枝的菌絲體,分基內(nèi)菌絲和氣生菌絲,氣生菌絲生長(zhǎng)到一定階段分化產(chǎn)生繁殖菌絲,由繁殖菌絲產(chǎn)生孢子.霉菌菌絲體(尤其是繁殖菌絲) 及孢子的形態(tài)特征是識(shí)別不同種類霉菌的重要依據(jù).霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細(xì)菌和放線菌粗得多,常是細(xì)菌菌體寬度的幾倍至幾十倍,因此,用低倍顯微鏡即可觀察.人們?cè)O(shè)計(jì)了各種培養(yǎng)和觀察方法,這些方法的主要目的是為了盡可能保持放線菌自然生長(zhǎng)狀態(tài)下的形態(tài)特征.本實(shí)驗(yàn)采用插片法.
插片法:將放線菌接種在瓊脂平板上,插上滅菌蓋玻片后培養(yǎng),使放線菌菌絲沿著培養(yǎng)基表面與蓋玻片的交接處生長(zhǎng)而附著在蓋玻上.觀察時(shí),輕輕取出蓋玻片,置于載玻片上直接鏡檢.這種方法可觀察到放線菌自然生長(zhǎng)狀態(tài)下的特征,而且便于觀察不同生長(zhǎng)期的形態(tài).

三、試劑與器材
1、材料 黑曲霉、青霉和根霉,細(xì)黃鏈霉菌或青色鏈霉菌,滅菌的高氏I號(hào)瓊脂和滅菌的查氏培養(yǎng)基.
2、實(shí)驗(yàn)器材 經(jīng)滅菌的:平皿、玻璃紙、無(wú)菌吸管、蓋玻片、玻璃涂棒,以及載玻片、接種環(huán)、接種鏟、鑷子、顯微鏡等.

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
倒平板→接種→插片→培養(yǎng)→鏡檢

五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)
1、倒平板要厚一些,接種時(shí)劃線要密.
2、插片時(shí)要有一定角度并與劃線垂直.
3、觀察時(shí),宜用略暗光線;先用低倍鏡找到適當(dāng)視野,更換高倍鏡觀察.
4、如果用0、1%美藍(lán)對(duì)培養(yǎng)后的蓋玻片進(jìn)行染色后觀察,效果會(huì)更好.

實(shí)驗(yàn)六 革蘭氏染色及芽孢染色
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />1、了解革蘭氏染色法和芽孢染色法的原理,并掌握其操作方法;
2、了解革蘭氏染色法在細(xì)菌分類鑒定中的重要性;
3、學(xué)習(xí)并掌握微生物涂片、染色的基本技術(shù)和無(wú)菌操作技術(shù);
4、學(xué)習(xí)顯微鏡(油鏡)的使用方法;
5、初步認(rèn)識(shí)細(xì)菌的形態(tài)特征.

二、實(shí)驗(yàn)原理
革蘭氏染色法的基本步驟是:先用初染劑結(jié)晶紫進(jìn)行染色,再用dian液媒染,然后用乙醇(或丙酮)脫色,后用復(fù)染劑(如番紅)復(fù)染.經(jīng)此方法染色后,細(xì)胞保留初染劑藍(lán)紫色的細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng)性菌;如果細(xì)胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細(xì)菌染上復(fù)染劑的顏色(紅色),該菌屬于革蘭氏陰性菌.革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌重要的鑒別特征,為保證染色結(jié)果的正確性,采用規(guī)范的染色方法是十分必要的.芽孢染色法的基本原理,用著色力強(qiáng)的染色劑孔雀綠或石炭酸復(fù)紅,在加熱條件下染色,使染料不僅進(jìn)入菌體也可進(jìn)入芽孢內(nèi),進(jìn)入菌體的染料經(jīng)水洗后被脫色,而芽孢一經(jīng)著色難以被水洗脫,當(dāng)用對(duì)比度大的復(fù)染劑染色后,芽孢仍保留初染劑的顏色,而菌體和芽孢囊被染成復(fù)染劑的顏色,使芽孢和菌體更易于區(qū)分.

三、試劑與器材
1、材料:枯草芽孢桿菌12～18h營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物,大腸桿菌約24h營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物
2、試劑 革蘭氏染色液(結(jié)晶紫液、dian液、95％乙醇、番紅液).5％孔雀綠水溶液
3、實(shí)驗(yàn)器材 小試管、滴管、燒杯、試管架、濾紙、木夾子、載玻片、蓋玻片、凹載玻片、無(wú)菌水、顯微鏡等、接種環(huán)、雙層瓶(內(nèi)裝香柏油和二甲苯)、擦鏡紙、生-理鹽水等.

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
1、革蘭氏染色法 制片→初染→媒染→脫色→復(fù)染→鏡檢.
2、Schaefer-Fulton氏染色法 制片→染色→水洗→復(fù)染→水洗→鏡檢.

五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)
1、涂片時(shí),生-理鹽水及取菌不宜過(guò)多,涂片應(yīng)盡可能均勻,
2、乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié),嚴(yán)格掌握脫色時(shí)間.

實(shí)驗(yàn)七 酵母菌的形態(tài)觀察及死活細(xì)胞的鑒定
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />1、觀察酵母菌的形態(tài)特征、出芽生-殖方式,并掌握酵母菌與細(xì)菌形態(tài)特征的區(qū)別.
2、學(xué)習(xí)鑒別死活細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法.

二、實(shí)驗(yàn)原理
酵母菌是單細(xì)胞的真核微生物,菌體比細(xì)菌大而且不運(yùn)動(dòng).酵母菌的繁殖方式分為無(wú)性繁殖和有性繁殖兩種,以無(wú)性繁殖為主.芽殖是酵母菌普遍的無(wú)性繁殖方式,少數(shù)為裂殖;有性繁殖是產(chǎn)生子囊和子囊孢子.本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)美藍(lán)染液水浸片和水一dian液水浸片來(lái)觀察酵母的形態(tài)和芽殖方式.
美藍(lán)是一種無(wú)毒性的染料,它的氧化型呈藍(lán)色,還原型無(wú)色.用美藍(lán)對(duì)酵母活細(xì)胞染色時(shí),由于細(xì)胞的新陳代謝作用,細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力,能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o(wú)色的還原型,而對(duì)代謝作用微弱或死細(xì)胞,無(wú)此還原能力或還原能力極弱,而被美藍(lán)染成藍(lán)色或淡藍(lán)色.因此,不僅用此法可觀察酵母細(xì)胞形態(tài),也可用來(lái)鑒別酵母菌的死細(xì)胞和活細(xì)胞.

三、試劑與器材
1、材料 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或卡爾酵母(Saccharomyces calsbergensis)培養(yǎng)2天左右的麥芽汁(或豆芽汁)液體培養(yǎng)物.
2、試劑 0.05％和O.1％呂氏堿性美藍(lán)染色液、革蘭氏染色用的dian液.
3、器材 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、灑精燈等.

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
1、美藍(lán)浸片觀察 酵母培養(yǎng)→制片→染色→鏡檢→30分鐘后再鏡檢
2、水-dian浸片觀察

五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)
1、染液不宜過(guò)多或過(guò)少,否則,在蓋上蓋玻片時(shí),菌液溢出或出現(xiàn)大量氣泡.
2、用鑷子取一塊蓋玻片,先將一側(cè)與菌液接觸,然后慢慢將蓋玻片放下,使其蓋在菌液上,蓋玻片不宜平著放下,避免氣泡產(chǎn)生.