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inverse-PCR是克隆插入片段側翼序列非常有效的方法。通常采用的Tail-PCR假陽性太多，而Inverse-PCR一般只要有特異條帶，基本上就是目的片段。

 

基本步驟如下：

 

1、反向PCR（Inverse PCR）原理：反向PCR是克隆T-DNA插入位點側翼DNA序列非常有效的方法。

 

a. 選擇合適的限制性內切酶位點。并在T-DNA的邊界（左邊界、右邊界均可）和酶切位點附近設計引物P1、P2；

 

b. 回收DNA，T4連接酶連接，使酶切后的DNA-片段環化；

 

c. 回收連接后的DNA，用引物P1、P2做PCR，就可擴增到兩端為T-DNA插入序列，中間為側翼序列的片段。

 

2、限制性內切酶消化：選擇合適的限制性內切酶，基因組一定要切成彌散性的條帶。在酶切之前，應對基因組DNA定量。

 

根據T-DNA的左邊界序列選擇合適的酶切位點EcoRI，BamHI和HindIII/PstI，并在酶切位點上游附近設計引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用這些內切酶分別消化基因組DNA，酶切體系如下：

 

Buffer for EcoR I	2μl
Genomic DNA	3μl
EcoR I	0.5μl （10u/μl）
ddH2O	14.5 μl
	20μl

 

37度 過夜，電泳檢測酶切效果。

 

3、回收DNA

 

① 將酶切產物轉到1.5ml離心管中，用ddH2O洗滌干凈，并稀釋到250μl；

 

② 加入等體積的酚和lv仿（V：V=1：1），渦旋混勻，室溫靜置1min；

 

③ da速度（13, 000 rpm）離心1min；

 

④ 將上清移到另一管中，加入等體積的lv仿，渦旋混勻，室溫靜置1min；

 

⑤ 大速度（13, 000 rpm）離心2min；