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你難道還在用質粒做 CRISPR 基因編輯？古朵新聞√
閱讀：49 發布時間：2019-12-5CRISPR-Cas9為基因工程領域打開了一扇嶄新的大門。這個相對簡單的分子生物學工具幾乎可以用來編輯任何基因組。CRISPR-Cas9 復合物由可編碼的 guide RNA (gRNA) 和 Cas9 核酸酶組成，這兩種成分結合形成核糖核蛋白復合物（RNP），然后結合并切割目標基因，再進一步利用細胞的修復機制來實現基因組的編輯。
在過去的幾年里，CRISPR-Cas9 技術已經被越來越多的研究人員所采用，并且在包括醫學、農業和疾病控制等許多領域產生了重大影響。
在設計 CRISPR 實驗時，gRNA 和 Cas9 的結構是一個需要考慮的重要因素。在瞬時轉染的時候 (即成分短暫存在于細胞內)，gRNA 和 Cas9 可以用質粒 DNA、RNA 或預先復合的 RNPs 傳遞。目前有許多研究人員傾向于選擇質粒，因為它們便宜、易于使用，而且可以加入標記基因。然而，用質粒表達 gRNA 和 Cas9 也存在一些問題。
在這篇文章中，我們將概述其中的一些缺陷，并指出為什么使用 RNPs 是更好的選擇的。
CRISPR 質粒轉染會增加脫靶效應
在任何 CRISPR 實驗中，令人關注的方面之一就是在錯誤的位置切割基因組 DNA，即脫靶效應。雖然精心設計的 gRNA 會在大多數情況下結合在正確的 DNA 位點，但是它們也可能會與只有少數錯配的序列結合。這些脫靶效應會造成嚴重問題，因為被錯誤編輯的基因位點可能會改變表型，或是對目標細胞與有機體產生有害影響。
CRISPR 組成以質粒形式導入常常與高水平的脫靶效應相關。這種效應是由于質粒在細胞內停留的時間相對較長，可能會持續數周。期間 gRNA 和 Cas9 會大量表達，因此有更大可能性使得 gRNA-Cas9 切割錯誤的位點。
幾項研究表明，當 CRISPR 組成成分以預先復合的 RNPs 而非質粒 DNA 的形式傳遞時 (Liang et al. 2015, Kim et al. 2014) ，脫靶突變的頻率較低。例如，Liang 等人 (2015) 發現，對于 OT3-18 基因，與質粒 DNA 相比，當使用 RNPs 時，脫靶突變與目標突變的比率降低了 28 倍。RNPs 較低的脫靶率可能與其在細胞內活性維持時間較短相關。與質粒不同的是，RNPs 在轉染后能迅速切割基因組 DNA，并且在細胞中只停留一天左右就被降解了 (Kim 等人 2014)。由于切割基因組 DNA 的時間更短，所以脫靶效應也減少了。
質粒 DNA 可能會整合到宿主基因組上
質粒轉染的另一個潛在問題是質粒 DNA 的全部或部分序列可能會隨機整合到目標細胞的基因組中。Kim 等人 (2014) 發現，質粒導致的插入普遍存在于目標和非目標位點。雖然可以通過測序檢測目標位點是否存在插入片段，但確定非目標位點的插入就變得困難許多，因此應當使用 RNPs 轉染來避免外源 DNA 整合進基因組。
RNPs 對細胞的毒性比 CRISPR 質粒小
DNA 轉染通常會給細胞帶來生存壓力，外源 DNA 的存在可能觸發人原代細胞和多能干細胞中環化 GMP-AMP 合成酶的激活。對于這種敏感的細胞類型，使用 RNP 而不是質粒轉染可以降低對細胞的毒性。根據 Kim 等人 (2014) 的研究，與質粒轉染相比，RNPs 轉染至少可以產生 2 倍以上的有活性的胚胎干細胞集落。
質粒表現出多變的 CRISPR 編輯效率
質粒可能存在質量問題。當 CRISPR 組分以質粒 DNA 的形式轉染時，在進行任何基因編輯之前，需要在細胞內進行 gRNA 和 Cas9 轉錄與 Cas9 翻譯。這不僅延長了實驗時間，而且 gRNA 的表達或者 Cas9 的組裝和折疊有出錯的風險。使用 RNPs 則可以避免這些問題，因為 gRNA 和蛋白質成分是在轉染之前制備的，而且 gRNA 和 Cas9 的質量可以在它們被導入細胞之前得到驗證。
RNP 的另一個好處是使得 gRNA 受到 Cas9 的保護，從而降低 gRNA 降解的風險。此外，合成的 gRNA 可以進行化學修飾，以防止核酸內切酶降解和免疫攻擊。這兩種因素都能使 gRNA 在短時間內更有效地靶向基因組 DNA (Hendel & Bak 等人 2015)。
考慮到 RNPs 的諸多優勢，它們在多種永生細胞、原代細胞和干細胞中都能一直保持高編輯效率也就不足為奇了，(e.g., Hendel & Bak 等 2015, Kim 等 2014, Liang 等 2015, Lin 等 2014). 此外，我們都知道通過同源定向修復機制實現基因敲入是一個效率極低的過程，但通過使用 RNPs 我們可以提升這一過程的效率。(Gaj 等 2017, Lin 等 2014, Schumann 等 2015).
用 RNPs 代替質粒來做 CRISPR 值得嗎？
當嘗試用 RNPs 替換質粒時，你可能仍然在想質粒的一些優點，比如，它們很便宜。但問問你自己，這些所謂的優點真的值得你在你的細胞中引入更多的脫靶編輯嗎? 或者甚至是將外源 DNA 整合進你的細胞賴以生存的必需基因中? 有些人或許會認為，質粒中可以加入標記基因 (如抗生素基因) 是一種無法比擬的優勢，因為它能使你富集被轉染的細胞。然而，由于使用 RNPs 通常會讓你的編輯效率超過 70%，所以向質粒中加入標記基因變得*不必要了。考慮到這些因素，你應該明白 RNPs 的好處已經遠遠超過其成本了。從今天起，讓 RNPs 成為你得心應手的 CRISPR 工具吧！
參考文獻
Gaj T. et al. 2017. Targeted gene knock-in by homology-directed genome editing using Cas9 ribonucleoprotein and AAV donor delivery. Nucleic Acids Research 45(11):e98.
Hendel A and Bak RO et al. 2015. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nature Biotechnology 33:985–989.
Kim S et al. 2014. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research 24:1012–1019.
Liang X et al. 2015. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology 208: 44–53.
Lin S et al. 2014. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, e04766-e04766.
Schumann K et al. 2015. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442.