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熒光免疫試驗方法及其分類

1）熒光免疫法： 

       原理是應用一對單克隆抗體的夾心法。底物用磷酸-4-甲基傘形酮，檢測產物發出的熒光，熒光強度與Mb濃度呈正比，可在8min內得出結果。結果以Mb每小時釋放的速率表示(△Mb)表示。該法重復性好，線性范圍寬，具有快速、敏感、準確的特點。

以雙抗夾心法為例，首先將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體。除去未結合抗體，然后加受檢標本，使其中的蛋白抗原與固相抗體形成抗原抗體復合物。洗滌除去未結合物，接著加入熒光標記的抗體，使之與抗原特異性結合，形成抗體—抗原—抗體復合物。zui后根據熒光強度，即可對蛋白抗原進行定量。       

傳統的熒光免疫法受本底熒光的干擾較大，時間分辨熒光免疫測定法是以具有特長壽命的稀土金屬如銪，作為標記物，加入正常液后激發測定，能有效去除短壽命本底熒光的干擾。
 2）放射免疫法
       放射免疫法是以過量的未標記抗原與放射性物質標記的抗原，競爭性地與抗體結合，形成有放射性的抗原—抗體復合物與無放射性的抗原—抗體復合物，并有過剩的標記抗原與未標記的抗原。然后通過離心沉淀等方法，將抗原—抗體復合物與游離抗原分離，分別測定其放射性強度與標準曲線比較，即可對未標記的待測抗原進行定量。

       RIA法測定血清蛋白靈敏度高、特異性強，可準確定量到ng／ml水平。但早期的方法操作麻煩，耗時長，且有放射性污染。近年來，隨著單克隆抗體的應用，RIA的靈敏度又有了較大提高，且操作大為簡化，并已有商品試劑盒供應，使用方便。
3）酶聯免疫法(ELISA)
       ELISA法有競爭法和夾心法兩種。競爭法是基于標準或血清Mb和微孔板上包被的Mb競爭性地與單克隆抗體相結合的原理而建立，該法的zui低檢測限為10μg／L，線性范圍達1 000ug／L。夾心ELISA法與EIA具有良好的相關性(r＝0.92)。ELISA法具有靈敏度高，特異性強，精密度好，操作簡單，適用于多份標本的檢測，不需特殊儀器設備等優點，易于推廣普及。但不適合急診的快速檢測。
以雙抗法為例。首先包被抗原，然后加入一抗，使一抗與包被抗原形成抗原—抗體復合物。接著加入酶標二抗，形成抗原—抗體—抗體復合物。zui后加入底物，由酶催化底物生成產物。通過產物的生成量即可對蛋白抗原進行定量。
 4）偶聯*—親和素系統的酶免法
       利用了一個親和素分子可以與4個*分子結合的特性，使傳統的靈敏度較高的酶免法的靈敏度又有明顯的放大作用。
5）時間分辨熒光免疫分析
       時間分辨熒光免疫分析（Time resolved Fluor immunoassay，TRFIA）是一種非同位素免疫分析技術，它用鑭系元素標記抗原或抗體，根據鑭系元素螯合物的發光特點，用時間分辨技術測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數進行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，*地提高了分析靈敏度。
6）解離增強鑭系元素熒光免疫分析

       解離增強鑭系元素熒光免疫分析（Dissociation Enhanced Lanthanide Fluor immunoassay DELFIA）是時間分辨熒光免疫分析中的一種。它用具有雙功能基團結構的螯合劑，使其一端與銪（Eu）連接，另一端與抗體/抗原分子上的自由氨基連接，形成EU標記的抗體/抗原，經過免疫反應之后生成免疫復合物。由于這種復合物在水中的熒光強度非常弱，因此加入一種增強劑，使Eu3 從復合物上解離下來，自由Eu3 同增強劑中的另一種螯合劑螯合形成一種膠態分子團，這種分子團在紫外光的激發下能發出很強的熒光，信號增強了百萬倍。因為這種分析方法使用了解離增強步驟，因此稱為解離增強鑭系元素熒光免疫分析。